무질서한 단백질 p27Kip1을 억제하는 소분자 발견

Scientific Reports 5권, 기사 번호: 15686(2015) 이 기사 인용

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무질서한 단백질은 생물학적 시스템에서 매우 널리 퍼져 있으며 수많은 신호 전달 및 규제 과정을 제어하며 그 수준 및/또는 세포 위치는 인간 질병에서 종종 변경됩니다. 접힌 단백질과 달리 구조적 이질성과 역학으로 인해 무질서한 단백질은 실행 가능한 약물 표적으로 간주되지 않습니다. 우리는 비록 약하기는 하지만 무질서한 세포 주기 조절자인 p27Kip1(p27)에 특이적으로 결합하는 작은 분자를 NMR 기반 스크리닝을 통해 확인함으로써 이 패러다임에 도전했습니다. p27 내의 방향족 잔기의 일시적인 클러스터에 의해 생성된 부위에 두 그룹의 분자가 결합되어 있습니다. 이 두 소분자 그룹 내에서 보존된 화학적 특징은 p27 내의 결합 부위에 대한 상보성을 나타내어 소분자:무질서한 단백질 상호작용에 대한 구조-활성 관계를 확립했습니다. 마지막으로, 한 화합물은 시험관 내에서 p27의 Cdk2/cyclin A 억제 기능에 대응하여 작은 분자가 접히고 자연 단백질에 결합할 수 없는 형태로 격리를 통해 무질서한 단백질(p27)의 기능을 억제할 수 있다는 원리 증명을 제공했습니다. 규제 표적(Cdk2/cyclin A).

본질적으로 무질서한 단백질(IDP)은 진핵 세포에서 매우 널리 퍼져 있으며 종종 조절 및 신호 기능을 수행합니다1. 구조적 클래스로서 IDP는 효모에서 인간까지 접힌 단백질보다 더 엄격하게 규제되며 과발현 시 접힌 단백질보다 세포 표현형을 변경하는 경향이 더 큽니다3. 따라서 정상적인 무질서한 단백질 항상성을 유지하는 것은 세포 행동에 매우 중요합니다. 접힌 도메인이 있는 단백질의 과발현 또는 과다활성과 연관된 표현형은 예를 들어 효소 기능(예: 만성 골수성 백혈병에서 BCR-Abl을 억제하는 Gleevec4) 또는 단백질-단백질 상호작용(예: ABT-)의 소분자 억제제에 의해 중화될 수 있습니다. 263 및 ABT-199는 혈액학적 및 림프성 악성종양에서 BCL-2 및 BCL-xL을 억제합니다5,6). 대조적으로, 무질서한 단백질은 역동적이고 이질적인 형태로 인해 소분자에 의한 억제가 어려운 표적입니다. 그럼에도 불구하고 진전이 이루어졌습니다. 예를 들어, 당뇨병, 비만 및 유방암에서 역할이 알려진 포스파타제 PTP1B(MSI-1436)의 억제제는 최근 구조적, 생화학적 및 기능적 분석을 통해 무질서한 조절 영역에 결합하여 알로스테릭 메커니즘을 통해 작용하는 것으로 나타났습니다. 효소 7. 또한 유잉 육종 계열 종양과 관련된 장애 EWS-FLI1 융합 종양 단백질에 결합하는 소분자(YK-4-279)는 종양 세포에서 EWS-FLI1의 기능적 파트너인 RNA 헬리카제 A(RHA)8에 대한 직접적인 결합을 억제했습니다8 RHA 의존성 단백질 상호 작용 및 RNA 접합이 변경되었습니다. 이들 화합물(MSI-1436 및 YK-4-279)은 모두 세포 분석에서 표적 효과를 나타냈습니다8,9. 다른 연구에서는 장애가 있는 cMyc10,11,12, α-시누클레인13 및 알츠하이머 β-아밀로이드 펩타이드14를 표적으로 하는 소분자를 확인했습니다. 최근 컴퓨터 연구15에서는 이전에 보고된 소분자(10074-A4)가 많은 무질서한 형태의 앙상블 내에서 서로 다른 cMyc 분자에 서로 다른 방식으로 결합된 cMyc 기능10을 조절한다는 사실이 밝혀졌으며, 이로 인해 저자는 "단백질에 결합하는 리간드 구름"이라는 개념을 제안하게 되었습니다. 구름". 위에서 논의한 연구에서 기능적 스크린, 시험관 내 결합 스크린 및/또는 컴퓨터 스크린을 포함한 다양한 접근법을 사용하여 무질서한 단백질을 표적으로 하는 소분자가 발견되었습니다. 접힌 단백질 표적에 결합하는 단편(16에서 검토됨)이라고 불리는 저분자량 소분자에 대한 핵자기공명(NMR) 기반 스크리닝은 약물 발견 과정에서 초기 "적중"을 식별하기 위한 잘 확립된 방법입니다. 그러나 NMR 기반 단편 스크리닝은 우리가 아는 한 무질서한 단백질 표적에 결합하는 작은 분자를 식별하는 데 적용되지 않았습니다. 여기에서 우리는 NMR 기반 스크리닝을 활용하여 진핵 세포 분열을 조절하는 사이클린 의존성 키나제의 조절자인 원형 무질서 단백질인 p27Kip1(p27; CDKN1B라고도 함)에 결합하고 그 기능을 조절하는 단편 분자를 식별했습니다.

50% increase; Fig. 6a and Suppl. Fig. 9b), consistent with partial displacement of p27-D2 from Cdk2/cyclin A by SJ403. Furthermore, in the absence of p27-D2, SJ403 substantially inhibited Cdk2/cyclin A activity at concentrations that, in the presence of p27-D2, were associated with p27-D2 displacement and increased kinase activity (Fig. 6b and Suppl. 9c). Thus, we conclude that the primary effect of SJ403 is displacement of p27-D2 from Cdk2/cyclin A (through the binding of SJ403 to p27-D2) and partial restoration of kinase activity, even as a secondary effect of SJ403 is to inhibit kinase activity (through the binding of SJ403 to Cdk2/cyclin A). These results provide proof-of-principle that a small molecule (SJ403) inhibits the function of a disordered protein (p27-D2) through sequestration in a conformation incapable of binding and inhibiting Cdk2/cyclin A./p>20 Å) and that Group 2 molecules bind to compact conformations when at least two of the three critical aromatic residues within the different sub-regions (sub-domains D2.1, D2.2 and D2.3) are clustered. Interestingly, analysis of the MD trajectory showed that Y88 and either W60 or W76 were frequently in close contact but that all three residues were rarely in close proximity (Suppl. Fig. 10c). This suggested that there are several different conformations with clustered aromatic residues (in particular, Y88 and either W60 or W76) capable of binding to Group 2 compounds, consistent with mutagenesis results showing that either W60 or W76, but not both, are dispensable for Group 2 compound binding (Suppl. Fig. 5a–f). In summary, the new MD results for p27-D2 suggest strongly that transient conformational fluctuations that create and disrupt clusters of aromatic residues modulate the binding of Group 1 and Group 2 small molecules to p27-D2. These results are consistent with the identification of W60, W76 and Y88 by NMR as the principal sites for compound binding and with results showing that binding is altered through mutation of these residues./p>2,300 compounds that were screened failed to bind other regions of p27 (sub-domains D1 and LH), suggesting that these other regions lack a sufficient density of aromatic residues (specifically, W and Y residues) to specifically recognize small heterocyclic aromatic molecules. Sub-domain LH, in isolation, does not bind to Cdk2/cyclin A but sub-domain D1 binds cyclin A with high affinity (Kd, 42 nM)45. We speculate that the RxLFG motif within this latter region, due to its limited length, cannot adopt conformations that create binding pockets for small molecules, as is possible for the much longer D2 sub-domain. However, the low affinity of the Group 1 and 2 compounds for p27 limits their applicability toward our broader goal of modulating p27 function in cells and, ultimately, humans. How can the affinity of small molecules for p27 be increased? We propose that the Group 1 and 2 molecules cause a degree of conformational restriction within p27-D2 and that molecules that enhance this restriction will exhibit higher affinity. We envision that small molecules with greater "three-dimensionality", that present chemically diverse and complex features, will be better templates for binding and sequestering p27. Efforts based on two strategies are underway to optimize our fragment hits using synthetic chemistry. First, we are "growing" the Group 1 and 2 scaffolds by introducing diverse chemical moieties at various positions on the heterocyclic ring systems to enable additional interactions with residues near W60, W76 and Y88 within p27-D2. Second, when the growing experiments are complete, we will synthetically "link" the optimal Group 1 and Group 2 molecules to further enhance binding to p27-D2. The results of these future experiments will indicate whether synthetic strategies for compound optimization that have emerged from structure-based drug discovery can be applied to a disordered protein. In conclusion, we have discovered small molecules with "fuzzy SAR" that mediate specific binding to and inhibition of p27, demonstrating the potential to rationally "drug" disordered protein targets in the future./p>500,000 compounds; see below). First, commercial fragment collections (subsets of larger diversity collections filtered for ‘fragment-like’ characteristics) were filtered to remove molecules containing inorganic atoms, isotopes, or invalid structures and to remove molecules that were not available in sufficient quantity (<50 mg). Passing molecules were abstracted to Murcko scaffolds using Pipeline Pilot (‘Generate Fragments’ component in Accelrys v. 8.5 with alpha atoms preserved, see ref. 48 for the general method). These scaffolds were further filtered according to the following rules: number of reactive substructures = 0 (‘REOS’ filters49,50,51, number of rotatable bonds <= 3, number of heavy atoms >= 10, number of rings >= 1 and number of ring substitutions >1 for single ring systems and number of molecules present in the St. Jude HTS library containing the scaffold >= 8. Molecules containing these scaffolds were identified in the commercial fragment libraries and then prioritized for purchase according to highest Oprea complexity52. This library has the following average calculated physicochemical properties: MW = 246 ± 39 Da, number of atoms = 17 ± 3, log P = 1.7 ± 1.0, polar surface area = 63 ± 19 Å2, number of H-bond acceptors = 4.3 ± 1.4 and number of H-bond donors = 1.3 ± 0.9. The distributions of these and other chemical features of the two fragment libraries are summarized in Suppl. Fig. 12a./p>

3.0.CO;2-Q" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291521-3773%2819990614%2938%3A12%3C1784%3A%3AAID-ANIE1784%3E3.0.CO%3B2-Q" aria-label="Article reference 36" data-doi="10.1002/(SICI)1521-3773(19990614)38:123.0.CO;2-Q"Article CAS Google Scholar /p>